mirna靶基因分析 mirna和靶基因结合位点预测

如何预测和鉴定miRNA的靶基因

利用生物信息学方法预测靶基因，一般数据库会通过基因的3'-UTR是否存在和miRNA互补配对的碱基序列进行判断。

mirna靶基因分析 mirna和靶基因结合位点预测

鉴定方法 荧光素酶报告基因检测，western blot等。

怎样研究mirna及靶基因的功能

木薯(Manihot esculenta Crantz)属于大戟科木薯属植物，典型的热带作物。低温是木薯获得高产优质的限制因子，microRNA(miRNA)作为逆境胁迫诱导的主要调控因子之一在木薯抗寒机制中占有重要地位。miRNA是一类长度约为21～25nt的非编码小RNA，它能识别特定的靶mRNA并在转录及转录后水平有负调控基因的作用。本研究旨在通过表型鉴定方法和分子生物学技术相结合共同探讨木薯抗寒基因的调控机理。

通过对术薯C4和SC124品种在低温胁迫处理下的形态生理指标监测和7个miRNA及4个靶基因的实时定量表达分析和功能分析，得出如下结论：

(1)在低温胁迫处理下，木薯的叶片数、叶绿素含量、脯氨酸含量和丙二醛含量变化显著，且这些指标变化与木薯叶片出现的冷害褐斑及叶片萎蔫程度等表型变化相一致。低温驯化(AH)和非低温驯化(NAH)的各项指标表明低温驯化能增强木薯的低温适应能力及恢复能力；同时也证实了C4比SC124具有更强的耐寒性。

(2)实时定量分析表明木薯中的7个miRNA受低温诱导表达，且它们在C4，和SC124品种中及不同的低温处理方式下都具有异表达；其中2个miRNA(miRNA1045125和miRNA3747522)的靶基因在两品种和不同低温处理方式下也具有异表达。

(3)通过对2个miRNA和它们靶基因的定量表达分析发现，无论在C4和SC124品种中还是不同低温处理条件下，2个miRNA与它们的靶基因之间都有明显的此消彼长的负调控作用；且4个靶基因在两个品种之间具有相反的表达模式。

(4)将miRNA1045125和miRNA3747522的4个靶基因在拟南芥和蓖麻基因组数据库中进行比对，它们在拟南芥和蓖麻中的主要功能是解旋酶、核酸酶、运载蛋白等。

如何筛选一个靶基因的mirna

利用各种生物信息学方法和实验方法来寻找miRNA的靶基因。，鉴定miRNA靶基因的常用方法是依赖计算机算法，如TargetScan、MiRanda和PicTar。它们预测miRNA种子区的结合。种子区（seed region）指的是miRNA上进化为保守的片段，从第2个到第8个核苷酸，通常与mRNA 3’-UTR上的靶位点完全互补。

如何分析microrna上游调控lncrna及下游靶基因

研究人类miRNA转录因子及靶基因之间的相关关系。方法利用生物信息学方法预测miR-NA的上游转录因子和下游靶基因,并对预测结果做基因本体分析,得到参与各生物学过程及分子功能的比例,用统计学软件PASW做相关性分析。结果人类382个miRNA参与应激、代谢、发育等10个生物学过程和行使转录调控、翻译调控、催化活性等12个分子功能,miRNA上游转录因子之间、下游靶基因之间以及上下游之间存在着广泛的正负相关关系。结论基因在参与生物学过程及行使分子功能的过程中,通过miRNA实现协同作用或隔离效应。

如何寻找与鉴定miRNA的靶基因？

一、miRNA的靶基因寻找

研究表明，一个基因可以受多个miRNA调控，而一种miRNA又可以参与调控多个靶基因，据预测，至少有30%的人类基因是miRNA的靶基因。这就足以显示出miRNA群体的重要性。而在人类疾病中多不同程度的表现出大量miRNA的上调和下调，这也足以显示miRNA在疾病发生过程中占据着非常重要的作用。而探讨miRNA的功能作用中重要的一步就是高效准确的寻找到其所调控的靶基因。目前寻找靶基因主要是从以下两个方面入手。

1．生物信息学方法

miRNA靶基因的预测主要是根据生物信息学的方式进行，主要是根据以下几个方面进行预测：①miRNA与靶基因结合位点的互补性；②miRNA靶位点在不同物种之间的保守性；③miRNA-mRNA结合的热稳定性；④miRNA靶位点处不应有复杂二级结构；⑤miRNA

5′端与靶基因的结合能力强于3′端。除以上几个基本原则外，

不同的预测方法还会根据各自总结的规律对算法进行不同的限制与优化。目前比较常用的靶基因预测软件有：miRanda、TargetScan、PicTar、miRWalk、miRanda、miRDB等，其中在miRWalk中可以查找到已经被研究证实的miRNA的靶基因，也可以查找与某种疾病相关的miRNA等。

虽然靶基因预测软件很多，但其预测特异性和敏感度还有待改善，一个软件针对一个miRNA通常可以预测出上千条靶基因，这就为后续的实验验证带来了许多困难，虽然我们可以结合多个软件进行miRNA的靶基因预测，但在取几个软件预测结果的交集时也忽略了许多真实的靶基因，在这两者之间的权衡就需要我们研究者去综合参考其他方面的因素来抉择。比如，我们可以结合DAVID软件对所选靶基因进行GO分析或通路分析，来针对某一特定功能方面进行靶基因的选择。

二、 miRNA靶基因的验证

与miRNA靶基因的预测方法相比，对miRNA靶基因进行实验验证的方法并不多，

目前还没有一个快速、简便、高通量的鉴定方法。直接的鉴定方法是， 利用荧光定量PCR及Western

blot方法分别检测转染或敲低miRNA后细胞中mRNA水平及蛋白水平的变化，从而确定miRNA与靶基因的对应关系。这种方法能够直接鉴定出miRNA的靶基因，

准确度高但不能鉴定miRNA的靶位点。

转染或敲低miRNA：方式主要有两种，一种是构建miRNA过表达载体的稳定表达系统，一种是人工合成miRNA类似物的瞬时表达方式。

miRNA的过表达载体中有插入成熟miRNA、pre-miRNA及pri-miRNA序列三种形式。其中pri-miRNA（含侧翼序列）的方式由于保留了每个microRNA独自的原始天然双臂结构，效果更好，是应用为广泛的方法。microRNA过表达系统中有CMV启动子（II型启动子）和H1启动子（III型启动子）两种方式供选择。

III型启动子（H1、U6等）具有表达效率高、有效的确定终止位置等优点，成为。II型启动子适用于pri-miRNA序列中有连续的5个T-导致III型启动子（CMV、Ubi等）终止转录的情况。载体系统也分多种，包括慢载体、腺载体、质粒载体等。瞬时过表达方式主要是经过人工化学修饰的运用化学方法合成的双链RNA，能模拟细胞中内源性成熟miRNA的高水平表达，以增强内源性miRNA的调控作用，进行功能获得性研究。只需直接转染进入细胞，即可检测功能变化，快速，方便。

miRNA靶位点鉴定：目前为常用的miRNA靶位点鉴定方法是荧光素酶报告基因法。其基本原理是首先构建荧光素酶表达载体，将希望鉴定的miRNA靶基因的3′UTR构建到荧光素酶基因的3′UTR中，之后将构建好的载体转染细胞并改变细胞中相应miRNA的表达水平，检测荧光素酶的表达情况以分析转染3′UTR中是否含有miRNA的靶位点。

miRNA的研究是医学科研领域中的一个重要方向。越来越多的研究揭示出其在疾病的发生及发展中处于重要地位，另外，它在疾病诊断、治疗及预后提示方面的作用也被有关研究所证实。在目前很多课题研究都会涉及miRNA领域，而了解miRNA基本研究思路及方法是研究中不可缺少的一步。在设计课题方案时，我们要灵活选择运用这些研究方法，以便使我们的研究方案更加新颖、合理、严谨。

如何预测和鉴定miRNA的靶基因

如何预测和鉴定miRNA的靶基因

miRNA sponge抑制载体，经特异地优化设计，增强吸附能力的同时增加了更多的结合位点，这样提高了成熟miRNA或siRNA抑制能力，消弱细胞中miRNA或siRNA导致的基因沉默效应，从而进行miRNA或siRNA功能缺失性研究。

MiRNA sponge载体与化学修饰的反义寡核苷酸相比，有它无可比拟的优势：a. 由于miRNA sponge是由质粒编码的，可以反复使用；b. 它能够通过包装慢颗粒达到稳定沉默细胞microRNA的细胞系，有利于进行对原代细胞和难转染细胞miRNA的抑制； c. 能够沉默整个家族的microRNA以达到对整个家族microRNA功能的研究； d. 可以利用miRNA sponge实现体内外loss of function研究；e. 可以用来检测luciferase靶基因报告系统分析；f. 可以自由组合串联不同miRNA抑制子序列，达到沉默多种不同miRNA的目的。